样品制备技术方法：减少基质效应

在液质定量分析中，实际样品中的目标分析物常与浓度远高于其自身的外源性和内源性化合物共存，例如代谢产物、蛋白质或磷脂，这些化合物的化学结构可能与目标分析物相似。

液相色谱 – 串联质谱（LC-MS/MS）已成为这类分析的标准技术。离子抑制是液质联用技术中常见的基质效应，其产生与质谱仪本身的灵敏度和选择性无关。通常，优化样品前处理流程是规避离子抑制的有效手段。本文阐述了多种样品制备技术（如蛋白质沉淀、液液萃取或固相萃取）的创新与策略，旨在减少液质分析过程中的基质效应。

目前，评估基质效应常用两种方法：柱后灌注法（定性）和提取后加标法，二者均可对基质效应进行定量评估（见图 1）。尽管在液质分析中，完全消除基质效应是不可能的，但可以通过使用适当的内标(IS)来在实验中进行补偿。

内标将经历与目标分析物相同的离子抑制或增强效应。若条件允许，应优先选用稳定同位素标记内标（SIL-IS）。

值得注意的是，SIL-IS 与非标记内标的洗脱行为几乎一致，但该类内标并非绝对可靠。虽然使用同位素内标(SIL)可以部分抵消基质效应，但由于这些效应引起的敏感度损失可能无法完全克服。

除了使用合适的LC–MS条件外，还可以对液相色谱和质谱的参数进行调整，并优化样品制备程序以消除基质效应。

总而言之，改善样品制备是克服离子抑制效应最有效的方法。传统的LC–MS分析的样品制备技术包括蛋白质沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)或固相萃取(SPE)。

蛋白沉淀

常用的蛋白质沉淀剂包括以下几类：① 水溶性有机溶剂（沉淀效率：乙腈＞丙酮＞乙醇＞甲醇）；② 酸类（三氯乙酸 [TCA，5%~15%]、高氯酸 [PCA，6%]）；③ 金属离子；④ 盐类。

在这些沉淀剂中，可与水混溶的有机溶剂和酸应用最为广泛。 其中，乙腈（有机溶剂类）、三氯乙酸（TCA，酸类）和硫酸锌（盐类）在各自类别中表现出最优的蛋白质沉淀效率 —— 当蛋白质与沉淀剂比例为 2:1 时，沉淀效率分别可达＞96%、92% 和 91%。此外，96孔蛋白沉淀滤板是一种自动化（高通量）选择。

蛋白沉淀技术的主要优点包括：操作简便；样品损失最小；试剂廉价；适用于多种目标分析物；易于自动化。缺点则包括：无法浓缩目标分析物；以及由于磷脂引起的显著离子抑制。

在蛋白沉淀后，含有乙腈提取液的样品中，磷脂的含量（约50%的总磷脂）低于甲醇提取液。

为降低磷脂带来的干扰，应在蛋白质沉淀（PPT）后（注：原文为 before PPT应为笔误），将上清液或经板内10000 Da 滤膜过滤得到的滤液用流动相稀释 40 倍。

近年来，研发出一类新型蛋白质沉淀板，此类滤板采用可特异性吸附磷脂的材料（如锆基二氧化硅，见图 2）。

液液萃取

液液萃取可采用单一不互溶有机溶剂（如正己烷、庚烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚）或混合有机溶剂完成。这种方法可以提高样品制备效率，或减少基质效应。通常，醇类（如1-丙醇或1-丁醇）或乙腈会被添加到相对非极性的溶剂中。

需将水相 pH 值调节至高于碱性目标分析物 pKa 值 2 个单位，或低于酸性目标分析物 pKa 值 2 个单位，使 99% 的目标分析物以非电离形式存在。强烈建议使用酸性或碱性pH值，以防止磷脂和胆固醇酯等杂质被萃取。

二次液液萃取（DLLME，注：原文 LLE 应为笔误） 可提升检测方法的选择性，同时最大程度降低基质效应。。首先，通常使用高度非极性溶剂（例如，己烷）来萃取疏水性的内源性干扰，同时使目标分析物保持在样品中。在移除并丢弃己烷层后，再使用适度非极性溶剂（例如，甲叔丁醚或乙酸乙酯）进行二次萃取。

盐析辅助萃取（SALLE）是一种替代的萃取方法，已被用于LC–MS生物分析。与传统的萃取方法相比，SALLE具有更广泛的适用范围，能够处理从低到高度亲脂的分子，并提供更好的目标分析物回收率。SALLE 的显著不足在于，其基质效应相较于传统液液萃取方法更显著；这是由于 SALLE 萃取液中通常含有更多内源性干扰物。

限制性介质-挥发性超分子溶剂（RAM–VOL–SUPRAS）已被提出作为一种新的策略，以快速去除蛋白质和磷脂，并在LC–MS生物分析期间高效提取目标分析物。

固相萃取（SPE）

固相萃取（SPE）技术可通过手动、自动化或与 LC-MS 系统在线联用等方式操作，既能选择性富集目标分析物（富集倍数可达 10~100 倍），也可分离生物样品中的干扰组分（例如采用氧化锆 – 二氧化硅复合固定相去除磷脂）。选择性的固定相可以通过离子、氢键作用，或偶极-偶极、偶极诱导偶极、或分散力作用来保留目标分析物。

为了在LC–MS/MS分析过程中，最小化血液样本中磷脂的影响，已对不同类型的聚合物固定相（例如，混合离子交换相、反相固定相和离子交换固定相）进行了评估。结合反相和离子交换机制的混合模式离子交换固定相，表现出最佳效果。

鉴于反相吸附剂对磷脂具有强吸附能力，可采用部分水溶液进行洗脱，从而从 SPE 柱中选择性洗脱目标分析物。

通过采用免疫吸附剂和分子印迹聚合物（MIP）等方法，可以通过特定分子识别来增强固定相的选择性，从而减少样本的背景效应。在这种情况下，物理和化学屏障，如限制访问材料（RAM），可以防止大型干扰分子，如蛋白质和磷脂被保留。

混合材料是有前景的吸附剂。RAM–MIP完美地结合了RAM和MIP的优点，提高了目标小分子选择性，同时，其亲水表面可以排除生物样本中的内源性化合物。

将不同的技术组合起来（例如，PPT/LLE、PPT/SPE、PPT/SALLE、SPE/DLLME或LLE/SPE），可以有效地降低样本的基质效应。

当前进展与未来趋势

近年来，样品前处理技术的发展趋势体现为：微型化、新型高选择性吸附材料的研发，以及与分析仪器的在线联用，最终实现高通量分析。

微型化系统需要更少的样品和有机溶剂，而在线系统则可以缩短样品制备步骤（从而减少人为错误并提高重复实验的准确性），同时降低分析时间和成本。在此背景下，在线毛细管固相微萃取（管内 SPME）与高效液相色谱（HPLC）耦合值得特别提及。

未来的发展方向包括将微型化的样品制备技术与微型化的色谱设备（如毛细管-LC和纳米LC）在线耦合。该联用策略有望实现更经济、更灵敏且更具可持续性的分析方法，进而对分析产生重要影响。