LC-MS/MS生物分析方法的开发和验证存在一些挑战。特别是，部分分析物回收率偏低且结果不稳定，尤其是疏水性较强的物质，往往会带来困难。
在样本收集、储存、制备及分析的各个阶段，分析物可能会在不同程度上丢失。通过计算整体提取回收率，可以检测到样本制备过程中的低回收率问题，但无法确定分析物丢失的具体原因。
分析物整个回收率偏低，是样本制备和分析各阶段多种损失叠加的结果。因此，在样本制备过程中确定分析物丢失的具体原因，有助于针对性优化生物分析条件，从而最大限度地减少这些损失。
生物分析支持贯穿于药物发现和开发的各个阶段。各类临床前和临床研究会产生数万至数百万份生物样本，这些样本基质类型差异显著，均需进行生物分析检测。
凭借其优异的灵敏度和选择性，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为支持药物发现与开发以及生物医学研究中定量分析的“金标准”。
为了确保它们具有稳健性、可重复性和可靠性，能够产生准确和精确的数据，所有生物分析方法都需要在不同程度上进行验证。美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）等监管机构发布了内容广泛的指南并持续更新，旨在确立用于药物发现和开发的生物分析方法的最低要求。
LC-MS/MS 方法的开发和验证面临着诸多挑战。部分分析物，尤其是疏水性较强的分析物，其回收率偏低且不稳定的问题，始终是行业攻关的难点。
多个治疗领域对疏水性化合物的分析需求正日益增长。约40%的已批准药物被归类为几乎不溶于水，近期研究预测，药物研发中近 90% 的候选药物为水难溶性 / 疏水性物质。此外，在生物标志物、代谢组学和脂类标记相关研究等其他领域，还经常遇到非药物疏水性分析物，例如磷脂、胆固醇、二十碳酸和胆酸。
根据FDA的定义，回收率是指“分析过程的萃取效率，以百分比表示，指通过对方法中样品萃取和处理步骤后，所能回收到已知量分析物的比例”。这是一个宽泛的定义，并未完全涵盖样品采集、储存和分析过程中分析物损失的所有方面。
生物分析中最简单、最基本的回收率形式是总体回收率，它可以通过质量控制标准测量值与标称浓度之比来计算。然而在实际检测中，回收率的判定远非单纯计算整体回收率那么简单，往往需要更深入的调查分析。例如，所用标准品的类型、制备方式、介质、浓度、储存条件及时间等，这些因素都会影响生物分析回收率判定的准确性。
此外，为了解决整体回收率低的问题，通常需要更深入地分析，以确定问题的根源。例如，造成整体回收率低的原因是什么？分析物是在何时、何处丢失的？是由于在萃取前、萃取过程中、再配制、萃取后，还是由于基质效应引起的？等问题，均需在优化生物分析回收率前明确答案。
将整体回收率拆解为各环节的独立损失项，是确定分析物具体损失位置的关键，唯有如此，才能有效地提高生物分析的回收率。
在样本采集、预处理和分析过程中，分析物可能在不同程度上发生丢失。本文仅考虑样本预处理和分析阶段发生的损失，这些损失是生物分析方法的固有问题，可以通过优化其参数来最小化。
相比之下，样本生成、采集等阶段的分析物损失，则属于测试系统的固有问题，超出了生物分析方法本身可调控的范畴。表1 总结了在样本制备和分析期间分析物丢失的常见来源，这些来源可以根据它们发生的样本预处理阶段进行分类。
表1. 样本制备与分析过程中分析物损失的常见来源
| 萃取前 | 萃取过程中 | 萃取后 | 基质效应 |
|---|---|---|---|
| 不稳定性：由基质引起的化学和生物降解 不可逆的与基质成分（如蛋白质、红细胞、盐类络合物等）结合 与试管壁的非溶性结合/不溶解/沉淀 | 不稳定：在乙腈（ACN）存在下，由基质引起的化学+生物降解 萃取效率低：无法将分析物从基质组分中充分释放 容器壁的非特异性结合/在乙腈中溶解度低/沉淀 蒸发/浓缩过程中的分析物降解 | 复溶问题：与残留基质不可逆结合，和/或与容器壁的非特异性结合 稳定性问题：在复溶溶剂中，由残留基质成分引发的化学和/或生物降解。 | 通过质谱源内源性化合物干扰来抑制/增强离子化 |
此外，每个阶段的损失可以分为两种类型：即时/与时间无关的损失，即分析物在加入基质时立即发生；以及与时间相关的损失，即随着时间的推移而加剧，这很可能是由于化学或生物降解造成的。正如稍后所解释的，将分析物损失的来源按此分类，有助于对其开展识别与定量分析。为有效优化生物分析条件、提升整体回收率，需先精准识别分析物损失的具体来源与作用机制。
基质效应和非特异性结合（NSB）是目前文献中研究最深入、也最受关注的分析物损失机制。
NSB 是分析物被实验器具（样品瓶、离心管、移液枪头等）内表面吸附而产生的损失。
研究已证实，药物会吸附在聚氯乙烯（PVC）输液袋和塑料静脉输液管表面，这类吸附甚至可能导致临床治疗失败。
已有研究报告显示，部分分析物因 NSB 造成的损失可超过 90%。分析物的吸附过程包含两部分：一是吸附于容器外表面，二是穿透并扩散至容器材料内部（即浸出）。
根据分析物和容器材料的不同，分析物吸附可以被描述为一种混合过程，包括相对快速的吸附（外表面结合）和较慢的浸出过程，两者在不同程度上发生。因此，由于NSB，分析物从容器中的流失过程通常呈现双相曲线特征：先经历几分钟内的快速、大幅流失，再进入数小时至数天的缓慢、小幅流失。
实验室器具的制备材料种类繁多，包括聚氯乙烯（PVC）、聚苯乙烯、聚丙烯（PP）、聚四氟乙烯、玻璃等。
分析物与实验室器具表面的相互作用，是离子 / 静电相互作用和疏水 / 范德华相互作用共同作用的结果。
静电相互作用发生在药物的离子功能基团与器具表面基团（如玻璃表面的硅羟基）之间，疏水相互作用则存在于疏水性药物与疏水性器具表面（如塑料）之间。
由于药物候选物越来越疏水，而且现在更常见的实验室器具使用疏水塑料而非玻璃，因此疏水吸附成为引发 NSB 的主要驱动力。
为减少分析物在塑料表面的吸附，可选用经亲水基团修饰的低吸附性样品容器和耗材。但亲水涂层也可能因离子相互作用而加剧分析物吸附。
可通过硅烷偶联剂处理玻璃表面，利用各类有机官能团掩盖其表面的活性游离硅羟基。
吸附程度取决于分析物性质、容器类型、温度以及生物样本的基质特性（如离子强度、pH值、脂类和蛋白质含量）。
例如，当样品 pH 低于分析物的 pKa 时，酸性药物在带负电表面的 NSB 会降低，而碱性药物在带负电表面（如玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯）的 NSB 则会增强。
样品基质和样品组成也起着重要作用。例如，当样本基质中缺乏蛋白质、脂类等大分子结合配体时（尿液、脑脊液、血浆透析液、血滤液、离心液、输液溶液等），NSB 会被显著放大；
而富含大分子的基质（如血浆、胆汁、组织匀浆）中，NSB 会显著缓解。
有机溶剂含量低的样本（如蛋白质结合、渗透性测定等体外实验的缓冲液），也易出现显著的 NSB。
或者，可以使用抗吸附剂来溶解分析物并/或阻止其吸附在实验容器内壁，如牛血清白蛋白（BSA）、3-
[(3 – 胆酰胺丙基) 二甲基铵]-1 – 丙磺酸盐（CHAPS）、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、聚山梨酯（吐温 20/80，即聚氧乙烯 – 2 – 壬基醚）、α/β/γ-环糊精、有机溶剂（甲醇、乙腈、二甲基亚砜、甲基叔丁基醚）、季铵盐以及更高浓度的缓冲液。然而，这些试剂可能会干扰色谱分析和/或质谱仪的离子化过程。
结合电喷雾电离（ESI）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术因其高灵敏度与高选择性，已成为药物发现和开发以及生物医学研究中定量分析的“金标准”。然而，ESI检测存在一个显著弊端，即“基质效应”。
基质效应由与目标分析物共萃取、共洗脱的基质内源性成分引发。这类干扰性基质成分会抑制或增强目标分析物在质谱源中的电离效率。
基质效应的外源性诱因还包括流动相中的缓冲盐、离子对试剂，以及实验器具和样品容器溶出的聚合物等物质。
基质效应可能由挥发性和非挥发性两种成分引起。非挥发性溶质会增加带电液滴的表面张力与粘度，进而抑制离子源中微小液滴的形成。而挥发性化合物则会与分析物竞争可用电荷和液滴表面位点。
一些研究表明，正离子电离模式下的基质效应，通常比负离子模式更强。这可能是由于在阴性极性模式下，蛋白质、氨基酸、缓冲盐等基质成分的电离程度更低，从而导致与电荷和液滴表面竞争的机会大大减少。