现代高效液相色谱方法开发主要依赖少数几种pH调节试剂和/或缓冲液，即使采用紫外检测法时这些试剂也广泛使用。这种现象主要源于质谱分析的要求。这些pH调节试剂与缓冲液的组合如表1所示。虽然理论上它们均与质谱兼容，但有时选择缺乏合理依据。
本文旨在重新审视HPLC缓冲液应用的基础原则，并重点介绍当常规缓冲液失效时可替代使用的其他高效缓冲体系。当分离开发遭遇瓶颈时，此举能有效节省时间与成本——当常规缓冲液均已尝试后，分析人员往往转向改变色谱柱化学性质，而这种调整未必必要。
表1：常用流动相pH调节液与缓冲液。
| pKa或缓冲范围 | UV截止波长 (nm) | |
|---|---|---|
| pH调节液 | ||
| 三氟乙酸 | 0.2 | 210 |
| 甲酸 | 3.8 | 210 |
| 乙酸 | 4.8 | 230 |
| 氨水 | 9.2 | 200 |
| 缓冲液 | ||
| 乙酸钠/乙酸 | 3.8-5.8; 8.2-10.2 | 205 |
| 甲酸钠/甲酸 | 3.3-4.3; 8.8-9.8 | 210 |
| 碳酸氢铵 | 5.9-6.9; 8.8-9.8 | 200 |
| 氨水缓冲液 | 8.2-10.2 | 200 |
缓冲液的重新审视
需谨记pH调节液本身不具备任何缓冲能力。这意味着当分析物遇到 pH 变化时（通常发生在样品稀释液与流动相于仪器管路或高效液相色谱柱顶端混合的过程中），可能导致峰形变差、保留时间重现性降低，甚至造成分离度恶化。
缓冲液在pKa值±1pH单位范围内展现最大缓冲能力。流动相pH值越接近缓冲液pKa值，所需缓冲液浓度越低即可有效抵御pH变化。液相色谱质谱联用（LCMS）应用中应控制缓冲液浓度在10mM以下，紫外检测应用中则建议低于25mM。
在低紫外波长（<220nm）工作时需考虑添加剂的紫外贡献，并合理设置紫外检测器参数以避免基线漂移。
当调整缓冲液水相部分的pH值以匹配已知或计算的分析物pKa值（即使pH值远离分析物pKa值）时，需注意有机组分加入后溶液pH值将发生变化。可遵循以下粗略经验法则：
针对酸性流动相和缓冲液
- • 每添加10%乙腈约升高0.22个pH单位
- • 每添加10%甲醇约升高0.15个pH单位
针对碱性流动相和缓冲液
- • 每添加10%乙腈约降低0.05个pH单位
- • 每添加10%甲醇约降低0.10个pH单位
需注意三氟乙酸（TFA）是强离子对试剂，在正离子模式下可能严重限制检测灵敏度——因其离子对强度足以在气相释放过程中与分析物形成中性复合物。 此外，TFA会”滞留”于质谱仪源内，需长时间清洗才能清除。TFA还可能与硅基HPLC色谱柱形成强疏水作用，显著改变色谱柱化学性质。多数用户建议使用TFA的色谱柱应专用于含此洗脱剂添加剂的分离。
乙酸铵在乙腈中的溶解度较低，当乙腈浓度超过60%时，需警惕流动相瓶及HPLC设备内壁形成无色盐晶体。
替代缓冲液与进一步思考
可替代三氟乙酸（TFA）的主要缓冲液包括：
- • 五氟丙酸（PFPA）
- • 七氟丁酸（HFBA）
- • 甲磺酸（MSA）
- • 碳酸氢铵
鉴于TFA存在诸多不良特性，用户往往转向替代缓冲体系，却未意识到存在多种更高碳链的全氟烷酸可配合质谱检测实现替代选择性。早在1996年文献中已有相关广泛报道。
图1：五氟丙酸（PFPA，pKa 0.18）与七氟丁酸（HFBA，pKa 0.4）
图1展示了两种可替代TFA的挥发性全氟酸。在反相色谱条件下，离子对链长增加将导致保留时间延长；但需谨慎添加离子对试剂以优化保留时间，过量试剂可能因吸附于硅胶表面引发多种静电效应，导致保留时间下降。
这些添加剂同样属于离子对试剂，但比TFA弱。离子对在电喷雾离子源内易解离，从而在气相中产生对应带电的分析物。因此检测灵敏度受影响程度低于TFA。这些试剂在电喷雾离子源内的滞留时间也更短。此外，每种试剂产生的分离选择性与TFA存在差异。 需注意这些试剂的酸性，应选用具有良好低pH稳定性的固定相。可能需要采用色谱柱清洗程序清除固定相表面的添加剂。
我们与其他文献报道共同发现，向样品稀释液中添加全氟烷基酸会显著影响峰形，有时还会影响色谱保留时间的稳定性。尤其处理高电荷化合物时更为显著。
甲磺酸（MSA）在紫外检测中亦可作为TFA的有效替代品。其酸性强于TFA，故在更低浓度下即可发挥同等效能（3mM MSA溶液的pH值相当于0.1% TFA溶液）。其缓冲能力在宽范围乙腈浓度下保持稳定，且具有195nm紫外截止波长的额外优势。MSA同样会改变相对于TFA的选择性，有研究指出在HILIC模式下向TFA流动相体系添加MSA可用于”调节”该分离模式的选择性。
碳酸氢铵是高pH条件下的优异缓冲剂，在pH 8-11范围内具有良好缓冲能力，且在较高离子强度下可能覆盖更广范围。其扩展缓冲范围源于氨-铵缓冲能力与碳酸氢盐-碳酸盐缓冲能力在传统”混合缓冲体系”中的叠加效应——即两种缓冲体系的pKa值相对接近。对比低pH条件下使用乙酸铵或甲酸铵缓冲液的情况，其铵盐与甲酸盐/乙酸盐的缓冲范围相差数个pH单位（见表1）。在此条件下，铵离子仅作为替代钠离子或磷酸根离子的质谱友好型配对离子。碳酸氢铵本身具有质谱友好性，且紫外截止波长为190nm。
这些缓冲液在pH 7时可能产生不稳定的保留现象，但这被认为是由于缓冲液在第一个和第二个pKa值之间的”谷区”缓冲能力较弱所致。pH值高于8的流动相应能产生非常有效的缓冲作用。
在高pH值条件下考虑分离问题时，我们注意到另一个有趣现象：当选择用于分离碱性分析物并进行质谱检测的缓冲液时，人们通常认为选择使分析物呈中性形态的流动相pH值（对于碱性分析物，流动相pH值需高于其pKa值）会降低分析物的检测灵敏度。 然而大量实例表明情况并非如此，这种现象被称为”反向电离”。据报道，该电离模式由以下过程驱动：
- 1. 近中性pH值的低离子强度溶液——电解产生的质子在液滴表面大量存在，分析物离子由此脱附
- 2. 强碱性氨溶液中，来自铵离子的气相质子转移可成为主导充电机制
- 3. 中性或高pH条件下高离子强度溶液亦会发生放电诱导电离
因此，即便理论上看似违背直觉，我们仍需探索高pH条件下碱性分析物的分离方法以获得替代性选择性。
关于质谱信号强度的补充说明：可通过强制形成加合物来提高分析物灵敏度，或在质谱色谱图中区分不同分析物。 例如可将乙酸钠或乙酸铵溶液注入柱后流动相流中促进加合物形成，此过程通常伴随分析物信号增强。为避免源污染或堵塞，通常采用1-5mM浓度溶液，且必须使用最高纯度试剂。
最后，近期报道一种极具价值的流动相添加剂，既能克服分析物在HPLC系统金属表面吸附的影响，又能改善阴离子分析物的峰形与检测灵敏度。亚甲基二磷酸（图2）可作为LC-MS分析中替代EDTA的有效选择，经证实能显著降低离子抑制程度。
图2：亚甲基二磷酸（pKa = 1.27）
该酸在肽类和蛋白质分析中尤为有效。通常向缓冲流动相（如乙酸铵体系）中添加5mM亚甲基二磷酸即可实现高效”失活”，从而改善峰形、检测灵敏度及定量重复性。
我强烈建议所有开发HPLC方法的研究人员，在开展实验前审慎评估所选流动相添加剂的适配性，并积极探索突破常规的缓冲体系。
原文来源：4.2: Overview of Extraction. (2024). Retrieved 7 September 2024, from https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/04%3A_Extraction/4.02%3A_Overview_of_Extraction