如何将LC方法转移到UHPLC上？

在将液相色谱（LC）方法转换为超高压液相色谱（UHPLC）时，切勿因各种设置而感到困惑。

色谱柱选择

假设您希望将等度液相色谱法转换为超高效液相色谱法，同时保持相同的分离度Rs。为帮助理解关键变量，请参考基础分离度公式：

其中N为塔板数，α为分离因子，k为保留因子。k和α的定义如下：

其中t_R为保留时间，t₀为色谱柱死时间（或缩写为t_m），k₁和k₂为两个相邻峰的保留因子。

为保持Rs恒定，需同时保持N、α和k不变。若假设系统性质（主要指流动相、色谱柱固定相及温度）不变，则k和α将保持恒定。这意味着当从常规液相色谱柱切换至超高效液相色谱柱时，必须保持色谱柱化学性质一致，因此仅能改变色谱柱长度L（单位：mm）、内径dc（单位：mm）和颗粒尺寸dp（单位：µm）。

保持N恒定的简易方法是确保L/d_p比值恒定。由于色谱柱长度和粒径规格有限，难以精确维持L/d_p比值不变，因此我们采用美国药典(USP)指南(1)规定的±50%至-25%容差范围。

以常规150 mm × 4.6 mm液相色谱柱为例，该柱填充5µmd_p颗粒，操作流速为1.0 mL/min。若需切换至d_p=1.7的UHPLC填料，可计算得(150 mm/5 µm)=30≈(50 mm/1.7 µm)=29.4，完全符合±25%的容差范围。通常UHPLC采用比常规LC更窄的色谱柱，因此可将150 mm色谱柱替换为50 mm × 2.1 mm × 1.7 µm规格的色谱柱。

流速优化

虽然并非强制要求，但建议在启动方法转换流程时，先使用新色谱柱建立方法，并调整流速以保持流动相通过色谱柱时的线速度不变。为保持线性速度恒定，流速调整需依据色谱柱横截面积变化进行，该变化与柱径比的平方成正比，即(2.1 mm/4.6 mm)² = 0.208 ≈ 0.2。因此初始流速1.0 mL/min需降至0.2 mL/min以获得相同线性速度。图1a和图1b分别展示了这两次实验的对比结果。可见除保留时间外（见色谱图下方保留时间对照），色谱图完全一致。根据理论推算，UHPLC运行条件下的保留时间应为常规LC运行条件下保留时间的三分之一，因为色谱柱长度缩短至三分之一。实际保留时间差异达35%，这是由于理想流速0.208 mL/min被四舍五入为0.2 mL/min所致。可通过比较超高效液相色谱运行中首个与末个峰的t0值比值及保留时间比值（图1b）进行验证——这些数值均达到常规液相色谱运行（图1a）的35%。

图1a所示色谱柱压力（未标注）为950 psi（约65 bar），而图1b中该值为2635 psi（约180 bar）。在超高效液相色谱条件下，我们可承受更高压力，若将流速增至1.0 mL/min，即可获得图1c所示色谱图。由于在UHPLC中使用的亚2微米颗粒色谱柱效率N值不受流速影响，我们预期图1c的色谱图应与图1a和1b相同，但保留时间更短。如预期所示，图1c的保留时间仅为图1b的五分之一——这源于流速从0.2 mL/min提升至1.0 mL/min的五倍增幅。压力值（未展示）亦同步提升至13,170 psi（约910 bar）。

梯度调整

到目前为止，一切进展都符合预期。从液相色谱（LC）到超高效液相色谱（UHPLC）的转换过程相当直接：只需保持N恒定且不改变系统化学性质，通过调整流速即可获得可接受的压力和较短的运行时间。图1c的运行速度比图1a快约14倍，这正是我们从LC转向UHPLC时所期望的改进效果。接下来让我们观察相同操作在梯度分离中的表现。

图2实验采用12种多环芳烃样品，初始条件为150 mm × 4.6 mm、5微米色谱柱，流速1 mL/min；梯度程序为30分钟内将乙腈浓度从45%升至90%。在每张色谱图中，我通过拉伸或压缩x轴使首尾峰值垂直对齐，从而实现图形的标准化处理。分离度最低的”临界”峰对为第3峰与第4峰，在图2a初始运行中两峰几乎重叠至基线。我添加了数条红色垂直虚线作为参考标记，以便追踪该峰对的位置，同时标注第9峰与第10峰的位置。

让我们采用与等度洗脱情况相同的逻辑，在50 mm × 2.1 mm、1.7 µm的色谱柱上以0.2 mL/min流速运行该方法，以获得相同的线性流速。结果如图2b所示。我们立即发现色谱图并不相同：两组峰均向（相对）较短的保留时间方向偏移。此外，峰3和峰4已实现基线分离——相较于图2a明显改善。这不能归因于N值增加，因为1.7微米色谱柱的N值实际比5微米色谱柱低约2%。

问题出在哪里？此时我们注意到：小粒径色谱柱长度仅为大粒径色谱柱的三分之一，因此t₀值也应缩短至三分之一（对比图1a与图1b的t₀值）。那么将梯度时间t_G缩短至三分之一（即从30分钟减至10分钟）会怎样？结果如图2c所示。此时所有峰位重新对齐，且图2a与2c中各峰对的分离度值可比性显著提升，符合预期。较短色谱柱的保留时间也缩短至原值的约三分之一。

图2a运行压力为465 psi（约30 bar），图2b和2c则为1285 psi（约90 bar）。这两者均远低于UHPLC方法预期所需的>6000 psi（>400 bar）压力。这意味着通过提高流速可进一步提升通量，正如我们在等度条件下从图1b切换至图1c时所实现的效果。

当我们将流速从0.2 mL/min（图2c）提升至1.0 mL/min时，得到图2d的结果。压力如预期增长至五倍（6420 psi，约445 bar），但分离效果却更接近图2b而非2a或2c。这显然存在问题！

梯度保留因子各不相同

正如我们在梯度法各种变化中观察到的那样，所得结果似乎与等度条件下的变化不一致。其原因在于梯度保留因子的计算方式与等度条件下的不同。梯度保留因子k^*可按以下方式估算：公式

其中F为流速（单位：毫升/分钟），ΔΦ为梯度范围（当前45%至90%梯度对应值为0.45），Vm为色谱柱容积（单位：毫升），S为特定分析物的常数。与公式1中恒流洗脱的k值类似，若要在梯度洗脱中保持分离度恒定，需同时保持N和k*恒定。梯度范围不应改变，因为这会改变系统化学性质，而样品未变，故S保持不变。由此可将公式4简化为：常数公式

也就是说，当我们改变梯度时间、流速或色谱柱尺寸时，需要进行补偿性调整以保持公式5恒定。我们还需要最后一个公式来估算Vm：公式

因此，我们的150 mm × 4.6 mm色谱柱具有Vm ≈ 1.6 mL，而50 mm × 2.1 mm色谱柱的Vm ≈ 0.11 mL。

让我们比较使用公式5时图2a-2d的运行结果：图2a中(30×1)/1.6=18.9；图2b中(30×0.2)/0.11=54.4； 图2c中，(10 × 0.2)/0.11 = 18.1；图2d中，(10 × 1)/0.11 = 90.7。（在此重申惯常提醒：若尝试复现计算，因四舍五入可能导致结果存在微小差异。） 由此不难理解为何图2a与2c结果相近（18.9≈18.1），而图2b与2d差异显著（18.9≠54.4≠90.7）。

我们还可利用公式5推导出如何调整图2d的条件，以在1 mL/min流速下获得与图2c相同的分离效果。若将梯度时间缩短至2分钟，则(2 × 1)/0.11 = 18.1，与图2c结果一致。图2e的实验数据验证了这一推测。若进一步调整参数以获得与图2a相同的分离效果（例如梯度时间设为2.1分钟时，
[2.1 × 1]/0.11 = 19.0 ≈ 18.9），但此操作可能得不偿失。

通过正确调整，我们使用更小的UHPLC色谱柱以1 mL/min流速运行时，将最后一个峰的保留时间缩短了约15倍。这与图1中等度洗脱条件改进所实现的节省效果相当。

总结

我们已经看到，将等度法从液相色谱条件转移到超高效液相色谱条件相当简单。只需找到与原始液相色谱柱具有相同化学性质且塔板数大致相同的色谱柱，然后调整流速以获得可接受的压力即可。我建议采取中间步骤，将方法转移到具有相同线速度的条件（例如从图1a到1b），但这并非必要。

然而将梯度方法从LC转移至UHPLC时需格外谨慎。即使色谱柱化学性质和塔板数相同，流速调整也必须配合其他补偿性改变，以确保公式5的结果保持恒定。本例中，不当选择导致相对保留时间和分离度出现微小变化，但幸运的是样品由相似化合物组成，这些化合物在条件改变时预计会产生相似的响应。若样品含不同官能团的分析物（如酸、碱、中性物）或更复杂的体系（如天然产物样品或蛋白质水解物），当梯度条件调整不当，某些峰对可能完全丧失分离度或出现保留逆转现象。

最后需特别提醒：图2示例数据经修改后，死体积均设为零。实际系统中，常规LC系统的滞留体积通常为1.5–3.5 mL，UHPLC系统为0.3–1.5 mL。当方法在不同系统间转移时，理论上死体积应与色谱柱容积Vm采用相同倍数进行换算。这增加了方法转移的复杂性，且往往对早期洗脱峰的相对保留影响大于后期峰。

核心结论是：将等度或梯度方法从LC转移至UHPLC通常会导致样品保留度大幅降低，但其挑战性远不止于更换UHPLC色谱柱和调整流速。因此，请务必注重基础操作规范，方能成功实现方法转移。