流动相pH值可成为控制保留时间和选择性的有力工具，但若控制不当则可能引发问题。调节流动相pH值是实现液相色谱分离的有效手段，本期将重点探讨流动相pH值在保留与选择性中的作用机制。
pH值与保留时间
在反相液相色谱中，保留时间主要取决于分析物的整体疏水性或非极性。极性较强的化合物通常比非极性化合物具有更短的保留时间。因此，典型色谱图的洗脱顺序通常为：从极性化合物到非极性化合物。若样品组分均为中性物质，流动相pH值通常可忽略不计。
图1色谱图即呈现此现象：约3至9分钟洗脱的无标记峰均为中性化合物。值得注意的是，当pH值从7.0（图1a）变为3.0（图1b）时，中性化合物的保留时间未发生改变。
当存在可电离分析物时，流动相pH值的改变会导致保留时间发生显著变化。如图1a所示，羧酸组分在pH 7.0条件下高度电离，其负电荷使其比pH 3.0条件下（图1b）的同种分子更具极性。由此可见，pH值对可电离化合物的保留时间具有显著影响。
一般来说，可假设色谱图在两个观测条件间呈现连续变化，且常可安全地将变化趋势外推至观测点之外。在pH 7.0至3.0区间，酸类化合物的保留时间将介于图1a与图1b所示值之间。
酸与碱的保留特性
随着 pH 值的变化，酸和碱的保留特性呈现相反趋势，如图2所示。在图2a中，我们看到酸在低pH值时保留良好，而在高pH值时保留较差，这与我们在图1中的观察结果一致。
碱的情况则恰恰相反（图2b）：在高pH值时，碱呈中性状态且保留良好；而在低pH值时，碱发生电离导致保留较差。
这些曲线的中点即为酸或碱的pKa值，此时半数分子处于电离状态，另一半则未电离。需注意：尽管pKa点同时存在电离态与非电离态物质，色谱图中仅呈现单一峰形。这是因为两种形态间的平衡速率远快于样品通过色谱柱所需时间，导致分析物在色谱行为上表现为存在分子的平均态。
当pH值向酸性方向偏移时，未电离态分子占比增加而电离态分子减少，导致酸的整体极性降低，保留时间随之延长（如图2a所示向左移动）。碱类物质对pH变化的响应则相反。
尽管在pKa值上下约1个pH单位范围内电离变化显著，但当pH值偏离pKa值2个pH单位以上时，曲线两端均趋于平缓。通常认为当pH值偏离pKa值2个单位时，酸或碱已完全电离或完全抑制电离。因此流动相pH值变化的影响取决于其与目标化合物pKa值的相对关系。这意味着若需通过pH调节保留时间，在pKa值±(1-1.5) pH单位范围内效果最佳。反之，为获得最稳定的保留条件，流动相pH值应与化合物pKa值保持>1.5 pH单位的距离。
pH的选择性力量
在含酸或碱样品的方法开发过程中，优化流动相pH值的真正魅力在于：不同化合物（尤其是pKa值相异者）的pH值与保留响应曲线存在显著差异。实际应用中，这意味着通过改变流动相pH值可获得显著的保留时间变化和峰间距变化。
图3展示了四种取代苯胺的分离实例，既体现了这一特性，也进一步阐释了图2b中碱类物质的普遍保留行为。图3a中各峰均标注编号，图3所有峰均采用颜色编码以便峰位追踪。需注意这些化合物的pKa值范围为2.66至3.98。
上述讨论表明，在pKa值±1.5 pH单位范围内最能有效改变保留特性，因此预期峰位移动最显著的pH范围应为(2.66–1.5)=1.1至(3.98+1.5)=5.5。图3展示了2 ≤ pH ≤ 5.5条件下的模拟色谱图；pH < 2可能导致色谱柱损伤，而pH > 5.5时这些分析物的色谱峰几乎与pH 5.5时无差异。
让我们检查各峰的移动轨迹，观察它们如何受pH值影响。峰4（黑色）的pKa值为2.66，在pH 2.0时将发生电离，因此在此pH值下保留能力最低。当pH值升至2.5以上时，非电离物质占主导地位，保留能力随之增加，这符合预期。
当pH值达到4.0（即pKa值上方约1.5个pH单位）时，电离作用受到抑制（如图2b右侧平坦区域所示），在pH 4.0–5.5的色谱图中几乎不再观察到保留时间的变化。峰3（橙色）具有相近的pKa值（2.75），因此峰3和峰4表现出高度相似的行为特征，在pH 4.0以上均保持稳定保留。尽管这两个峰的保留时间随pH变化，但选择性因子α仅发生微小变化（α值范围为1.36–1.40），故在所有显示的pH值下均能良好分离。（注：α为相邻两峰保留因子k的比值，本例中α=k4/k3）
峰1（绿色，pKa=3.98）与峰2（红色，pKa=3.52）的保留规律类似。随着pH值升高导致电离程度降低，这两峰同样向更高保留时间迁移。然而，由于峰1和峰2的pKa值比峰3和峰4高约1个pH单位，其保留时间直至pH值升高约1个单位（即pH 5.0及以上）才趋于稳定。遗憾的是，峰1与峰2之间的选择性随pH值升高而下降——从pH 2.0时的α=1.64降至pH 5.5时的1.05，因此分离效果随pH值增加而恶化。
流动相pH值与稳健性
从色谱角度而言，这意味着需确定色谱变量可调整的范围，在此范围内仍能提供合格的分析结果。当前背景下，这要求通过稳健性实验确定流动相pH值可变范围仍能保持充分分离的极限值。
图4所示胆汁酸样品色谱图（4）展示了pH耐受性差的方法实例。在图4a中，流动相pH值为5.1时所有峰均实现基线分离。然而当pH值调整至5.2（图4b）时，最后两个峰合并为分离不良的双峰（箭头所示）。使用pH计调节溶液pH值时，常规实验室误差通常为±0.05-0.1 pH单位。当通过滴定调节缓冲液pH值时，不同批次缓冲液制备产生的差异（如图4a与4b所示）并不意外。因此，若规定流动相pH值为5.1，分离效果将缺乏足够的稳健性。
让我们探讨如何为图3所示样品建立具有可接受稳健性的满意分离条件。通常我们期望等度保留因子k值在2-10之间，但若无法达到该范围，1-20的范围通常也可接受。同时需明确要求峰间基线分辨率。此外，我们期望方法能尽可能耐受pH值变化。
图2a中pH 2.0的分离效果良好，但前两个峰的k值均小于1，这意味着在实际样品分析时，色谱柱死时间t0存在干扰风险。在pH 2.5条件下（图2b），首峰k值约为1且分离充分，故该pH值可接受。在pH 3.0条件下（图2c），峰2已部分越过峰3，分离效果不足。pH 2.75条件下（色谱图未展示），峰3刚好与基线分离于峰2之后，此值约为最大可接受pH值；所有更高pH值条件下均出现峰重叠现象。
鉴于2.0 ≤ pH ≤ 2.75范围内均能获得可接受分离度，我们可将默认pH值设定于该区间中点（例如pH 2.35）。在方法验证阶段，可分别在pH 2.05和2.65条件下进行实验。若这些条件能满足分离要求（及其他方法性能要求），则可将方法pH值定义为2.35，并允许±0.3pH单位的调节范围。方法文件中明确此规则后，分析人员即可通过±0.3pH单位的调节实现系统适用性。
为确保流动相稳定性，我们在流动相中添加缓冲液。缓冲液在距其pKa值±1 pH单位范围内效果最佳。磷酸盐具有三个pKa值（2.1、7.2和12.3），因此适用于pH 2.35 ± 0.3的范围。相比之下，醋酸盐的pKa值为4.8，不适合作为图3样品的缓冲剂。
另一方面，若需在pH 5.1条件下运行图4所示方法，则应选用乙酸盐而非磷酸盐作为缓冲剂。大多数液相色谱方法通常采用20-30 mM的缓冲浓度，但使用当今高纯度硅胶色谱柱时，5-10 mM的低浓度亦可满足要求。
总结
流动相pH值对中性化合物的保留影响甚微，但若样品中存在可电离化合物，则需控制pH值以稳定保留特性。在方法开发阶段，流动相pH值可成为调整色谱图峰形和位置的高效工具；
但反之，在常规分析中需严格控制pH值以维持稳定的分离条件。选择缓冲液调控流动相pH时，务必选用 pKa 值与目标 pH 值相差不超过1个pH单位的缓冲液，否则其缓冲能力可能不足以稳定保留。