为什么液相色谱的保留时间有时需要很长时间才能稳定？
柱清洗与再平衡
许多液相色谱法用于测定某种样品基质中的一种或多种分析物。这种基质可能涵盖从药物制剂中的辅料到血液、组织、植物材料乃至土壤等环境组分。通常基质中含有不受关注的强保留化合物。样品净化过程常用于减轻这些强保留物质的干扰，但该过程永远无法达到100%有效。
因此，大多数”真实”样品中都存在比最后洗脱的目标化合物更强保留的组分。为避免这些杂质积累引发问题，色谱柱需定期清洗。清洗后的色谱柱可保存存待下次使用，或经流动相重新平衡后立即投入使用。
等度洗脱法中最常见的色谱柱清洗程序是两步法。
首先从系统中清除缓冲液，然后用比流动相更强的溶剂对色谱柱进行冲洗。若在反相分离中使用乙腈作为强溶剂，清除缓冲液尤为重要，因为磷酸盐等缓冲液在高浓度乙腈中往往溶解度极差。例如，当流动相为50:50的25 mM磷酸盐缓冲液-乙腈体系时，理想操作是使用50:50水-乙腈洗脱5到10个色谱柱体积以清除缓冲液。
另一种更便捷的方法是用5-10个色谱柱体积的水进行洗脱，但这可能导致色谱柱经历”脱湿”过程。脱湿现象通常发生在C8或C18色谱柱上，当流动相被水置换时，由于极性差异极大，水无法渗透到键合相中。这种情况通常是不理想的，可能导致保留时间发生意外变化。
然而，若脱湿后立即用100%有机溶剂（如乙腈或甲醇）冲洗，可在洗涤色谱柱的同时逆转该过程。清除缓冲液后，需使用比常规流动相更强的溶剂进行冲洗。最便捷的方法是用强溶剂（通常为乙腈或甲醇）冲洗10-20个柱体积。随后可将色谱柱储存于乙腈或甲醇中，直至下次使用。
梯度洗脱法至少具有部分内置的色谱柱冲洗功能，因为每次梯度循环都会运行至强溶剂条件。若存在晚洗脱物质残留，可修改梯度程序使每次运行结束时延长至100%有机溶剂浓度，从而实现每次运行都完成色谱柱冲洗。
等度或梯度冲洗法对多数常规反相色谱方法已足够。有时使用更强溶剂冲洗可能有效。但依我之见，采用强溶剂冲洗或极端柱修复程序通常得不偿失。此类技术虽可清除强保留物质，但当需采取极端措施时，色谱柱恢复原始性能的情况已极为罕见。我在此多次强调：色谱柱应视为消耗品。
洗涤后的色谱柱，通常应保存在洗涤溶剂（乙腈或甲醇）中直至下次使用。要使其重新平衡至正常工作状态，用10-20个色谱柱体积的流动相进行平衡通常就足够了。
什么是柱体积？
在大多数情况下，负责去除杂质或重新平衡的是流经色谱柱的溶剂体积，而非冲洗时间，因此提高流速通常能加速该过程。色谱柱体积（VM）可通过两种方法估算。对于内径为4.6毫米的色谱柱：
其中L为柱长（单位：毫米），体积单位为毫升。当然，该公式不适用于其他直径的色谱柱。此类情况请使用
其中dc为色谱柱直径（单位：毫米）。两种方法测得的色谱柱体积误差均在10%以内。可见，对于150×4.6毫米内径的色谱柱，公式1计算得出体积为1.5毫升，而公式2得出1.6毫升，两者均足够接近，满足当前需求。
平衡问题
最近收到一位读者的提问（经轻微编辑后如下）：
我开发了一种以五烷基磺酸钠为离子对试剂的方法。我认为用30柱体积的90:10水-乙腈洗洗柱，再切换到40:60水-乙腈即可。问题在于，洗脱后有人会用10-15倍柱体积的5:95水-乙腈溶液进行终洗。这最后一步似乎对色谱柱危害极大。我们知道洗脱后离子对试剂无法完全清除，因此该色谱柱专用于离子对分析。
但我认为95%乙腈浓度过高，可能导致离子对试剂在色谱柱内沉淀。通常在40:60水-乙腈洗脱后，经流动相重新平衡，分离溶液的色谱图从未出现异常。
但当操作人员引入95%乙腈洗脱步骤后，后续分析的分离度检测无法通过，且色谱柱似乎无法恢复。即使运行3小时后，系统仍未达到平衡状态。这种现象是高浓度乙腈导致离子对试剂在色谱柱上沉淀所致，还是另有原因？
该问题凸显了与色谱柱平衡相关的若干潜在问题。首先，在离子对条件下，色谱柱平衡速度极慢，且实际操作中离子对试剂一旦进入色谱柱便无法完全清除。这导致行业普遍采用专用色谱柱进行离子对分析，而非尝试将其用于非离子对方法。
离子对的第二个问题是平衡过程通常相当缓慢。经验法则表明：当从水/缓冲液与乙腈/甲醇混合溶剂切换时，10倍柱体积的流动相即可实现平衡；而离子对条件下可能需要20-50倍柱体积甚至更多才能达到平衡。
请注意，题目中提到色谱柱最初是用高浓度水溶液（90:10水-乙腈）进行洗涤的。这符合我之前提出的建议：在用更强的溶剂冲洗之前，先将缓冲液（本例中为离子对试剂）从色谱柱中冲洗干净是个好主意。
在此情况下，90:10水-乙腈溶液最为理想：因离子对试剂具有水溶性，且10%乙腈浓度可避免色谱柱脱湿风险。使用非缓冲流动相冲洗对乙腈至关重要，因为缓冲液和离子对试剂在高浓度乙腈中溶解度极低。若直接从流动相切换至100%乙腈，我担心会导致色谱柱内盐类沉淀。
通常建议在90:10水-乙腈冲洗后，采用90-100%乙腈清洗色谱柱（正如读者同事所做）。但读者发现40:60水-乙腈比例已能清除其关注的污染物，且更高浓度乙腈冲洗反而对色谱柱产生负面影响。
此类情况恰恰说明实证数据应优先于理论——当然需结合常识判断。正如我最推崇的I.M. Kolthoff名言所言：”理论指引方向，实验决定结果。”
本案例中，40:60水-乙腈洗脱既满足应用需求，又避免了强溶剂洗脱引发的问题。运用常识需考察40:60水-乙腈洗脱液相浓度。虽未知该方法流动相具体组成，但推测其强度不应超过40:60离子对-乙腈体系。对于反相色谱（含离子对体系），冲洗溶剂强度应始终不低于流动相。
问题依然存在：为何在用水-乙腈（10:90）冲洗后，色谱柱性能会如此恶化？我认为问题与离子对试剂沉淀无关，因为绝大多数离子对试剂本应已被水-乙腈（90:10）冲洗液从色谱柱中清除。目前尚不确定问题根源在于离子对条件还是色谱柱本身，但这让我想起多年前关于反相色谱柱平衡问题的观察结果。
慢速柱平衡
几年前在我们实验室进行的色谱柱测试项目中，我们观察到一种非常奇特的平衡问题，这促使我们更深入地研究色谱柱平衡问题。如图1所示，当使用pH 2.8磷酸盐-乙腈（50:50）流动相对新C18色谱柱或曾浸泡于非缓冲流动相的色谱柱进行初始平衡时，阿米替林等离子型化合物呈现极缓慢的平衡速率。
经20倍柱体积的流动相冲洗后，中性化合物（如乙苯）的保留时间趋于稳定。然而某些情况下，阿米替林的保留时间持续漂移超过10小时。这种现象与常规经验法则相悖——通常认为更换流动相或冲洗色谱柱后，10-20倍柱体积的流动相即可完成平衡（如前所述，离子对条件除外）。
进一步实验表明：该现象与时间相关而非体积相关。通常我们观察到，色谱柱冲洗或平衡过程取决于流经色谱柱的溶剂总体积，而非时间。因此，提高流速通常可缩短平衡时间。
但对于缓慢平衡问题则不然：关键因素是时间而非体积。当缓冲液被移除或流动相pH值改变后又恢复初始条件时，缓慢平衡现象似乎仅限于离子化化合物（酸和碱）。
中性化合物似乎不受此影响，其平衡可在预期的小于20柱体积区间内完成。在较高pH条件下（例如pH 7）使用时，缓慢平衡问题显著减轻。正如时间相关化学过程所预期的那样，温度升高可缩短缓慢平衡过程的平衡时间。
最后，基于对八家制造商19根色谱柱的有限研究发现，约40%的色谱柱在检测阿米替林时表现出缓慢平衡，其余色谱柱则快速达到平衡。
实际考虑
如何将上述讨论的观察结果应用于实验室实践？以下是我的部分结论：
- • 由于在低pH值或离子对条件下使用碱性化合物时，缓慢平衡现象普遍存在，因此在首次建立方法时，最好采用经验性测试来评估色谱柱平衡状态。具体操作建议：先用流动相冲洗色谱柱10到20个柱体积，随后开始进样并观察保留时间漂移现象。稳定的保留时间可作为所需平衡时间的参考指标。若平衡迅速则无需额外处理；若未达标则需采取补救措施。
- • 当观察到缓慢平衡现象时，将色谱柱浸泡于流动相中可缓解问题。相较于非缓冲条件，采用缓冲流动相或离子对条件储存时，色谱柱寿命可能略有缩短。但需权衡等待平衡的时间成本与频繁更换色谱柱的经济成本。
在慢平衡条件下，色谱柱平衡过程取决于时间而非体积，因此用流动相储存还能节省溶剂成本。我不建议将缓冲流动相留在液相色谱系统中，因为存在缓冲液沉淀、蒸发及其他潜在问题。
正确做法是：用流动相充满色谱柱后将其移出系统并严密封盖，随后冲洗系统清除缓冲流动相。
另一方案是将色谱柱留在系统中，将流速降至最低（例如0.1 mL/min），既可节约溶剂又避免流动相在系统中滞留。
若色谱柱仅偶尔使用，可按常规方式用无缓冲强溶剂（如100%乙腈或甲醇）冲洗色谱柱，然后将其储存在该溶剂中。下次使用前一天，可用10-20个色谱柱体积的流动相冲洗色谱柱，并将其浸泡于该溶剂中过夜，确保次日清晨色谱柱完全平衡。 - • 在非离子对条件下观察到某些色谱柱平衡缓慢的现象，进一步印证了为每种液相色谱方法配备专用色谱柱的合理性。从长远来看，若每种方法都配备专属色谱柱，您的色谱柱预算不会增加，且潜在问题风险更低。
关键在于运行液相色谱方法时需保持警惕，尤其在初始设置阶段。采用10-20倍柱体积进行平衡的常规做法依然有效，但需认识到规则存在例外情况。