问： 我在样品前处理过程中遇到了一些问题，使用的是反相吸附剂-固相萃取（RP-SPE），通常回收率尚可，能达到 80% 或更高，但有时会下降至 50% 甚至更低，可能是什么原因？
答： 你遇到的该问题十分常见，多数情况下低回收率可归因于方法开发不当。尽管 80% 的回收率对于方法的分析目的而言或许足够，但从方法耐用性的角度来看，这并非理想结果。极有可能是单一原因导致的回收不完全，该原因有时会造成 20% 的待测物损失，严重时损失率可达 50%，需通过排查确定这 20%~50% 损失的待测物去向。
问： 好的，那该如何开展排查？
答： 待测物损失主要存在四种可能的情况：
- • 待测物在固相萃取前就已损失；
- • 吸附步骤中，待测物未被 SPE 柱完全吸附；
- • 洗涤步骤中，部分待测物被洗脱流失；
- • 洗脱步骤完成后，部分待测物仍残留在 SPE 柱上。
为验证吸附步骤中待测物是否发生穿透，可在第一根 SPE 柱后串联第二根 SPE 柱，后续按相同方式处理两根柱子。若第二根 SPE 柱的洗脱液中检测到显著量的待测物，即说明吸附步骤不完全。出现该问题主要有两方面原因：
第一，溶解样品的溶剂洗脱能力过强，若为此种情况，可用水稀释样品；若待测物为可离子化物质，也可用缓冲液稀释。
第二，需确认上样前是否完成 SPE 柱的活化操作，反相 SPE 柱需先用甲醇、乙腈等有机溶剂活化，再用水或缓冲液平衡，完成后才能进行上样。不少实验者会省去这些看似繁琐的步骤，但此类活化与平衡操作是保证方法有效性的必要步骤。
问： 我是按照制造商的建议完成SPE柱活化的，所以认为问题并非出在这里。我十分赞同用串联第二根柱的方式验证吸附步骤的完整性，那该如何检查方法的其他步骤？
答： 检查洗涤步骤时，需收集所有洗涤液并通过高效液相色谱法分析。若洗涤步骤会去除干扰待测物定量的化合物，那么直接分析洗涤液中的待测物会存在难度，可通过以下方法解决：将可疑洗涤液蒸干，用与原始样品相同的溶剂体系复溶，随后将该复溶液按原始样品的处理方式通过 SPE 柱，若此次洗脱步骤中检测到待测物，即可判定部分待测物在洗涤步骤中发生了流失。
另一种方法是将标准品全程通过样品前处理流程，不过该方法的严谨性相对较低，因为样品基质的存在可能会改变待测物的吸附与洗脱行为。
问： 这些建议很实用，那该如何检测洗脱步骤后残留在 SPE 柱上的待测物？
答： 在原始洗脱步骤完成后，可继续用更多洗脱液对 SPE 柱进行二次洗脱，此举可洗脱出柱上残留的待测物。通常情况下，需要提升洗脱液的洗脱强度，具体调整方式可根据待测物的保留原因判断：
- • 是否为待测物与填料残留硅醇基发生相互作用？若是，可调整洗脱步骤中缓冲液的 pH 值或缓冲液浓度；
- • 是否为疏水相互作用导致的强保留？若是，可提高洗脱液中有机溶剂的浓度，或更换洗脱能力更强的有机溶剂，例如用乙腈替代甲醇；
- • 待测物是否通过氢键与残留硅醇基结合？若是，可在乙腈或四氢呋喃洗脱液中加入甲醇，以缓解该相互作用。
问： 好的。如果通过上述所有步骤都未找到损失的待测物，是否可以排除固相萃取步骤是问题源头？
答： 可以。此时需要进一步排查，确认待测物是否在样品前处理的其他环节发生损失。可能的原因包括：待测物是否被强烈吸附至样品容器内壁？强疏水性待测物易吸附在聚乙烯样品瓶的瓶壁上，强碱性化合物则可能与玻璃样品瓶表面的硅醇基发生结合；待测物也有可能吸附在基质中的固体颗粒上，或与基质中的其他成分（如蛋白质）发生结合。此类问题的排查难度相对更高。
从根本上来说，应尽量让待测物的回收率接近 100%，这是保证方法从开发阶段就具备良好耐用性的关键。即便达到这一标准，仍有可能出现回收率波动的情况，但发生概率远低于从存在缺陷的方法开始实验。
若能从开发阶段就获得较高的回收率，那么洗脱液组成或填料固定相的正常批次差异，便难以对方法回收率产生影响。此时唯一可能导致回收率不稳定的原因，就是 SPE 柱的柱床质量问题。
若 SPE 柱床出现空隙，会造成流速不均，进而导致待测物提前穿透，该问题可通过肉眼粗略检查 SPE 柱进行防范，会对实验造成影响的柱床空隙通常肉眼即可清晰辨认。