问： 色谱图中色谱峰的保留时间出现漂移，可能是什么原因？
答： 造成这一问题的原因比较多，下面逐一分析。通常首先会考虑是色谱柱未达到平衡所致，若使用未改性硅胶柱开展正相色谱分析，这确实是最可能的原因。
正相色谱的保留时间对硅胶表面的吸附水量极为敏感，而吸附水量又由流动相中的溶解水量决定。由于水在正己烷、二氯甲烷这类溶剂中的溶解度极低，色谱柱的平衡过程会非常耗时。
曾遇到过在极干的正己烷体系中，即使平衡一周，保留时间仍在漂移的情况。因此，建议避免使用极度干燥的溶剂。解决硅胶与水相平衡问题的一个常用方法是使用水“半饱和”的溶剂。其制备方式为：将一定体积的疏水性溶剂用水充分饱和后，再与等体积的“干燥”溶剂按 1:1 比例混合。该方法能大幅缩短色谱柱的平衡时间。
反相色谱的平衡通常很快，一般通入 5~10 倍柱体积的流动相即可。但也存在特殊情况，离子色谱中使用离子对试剂平衡色谱柱就是一个典型的例外。离子对试剂的常规使用浓度为 2~5 mmol/L，甚至更低，其在反相填料表面的吸附浓度约为 0.5~2 μmol/m²。
以一根 4.6 mm×250 mm 的色谱柱为例，柱内填料约 3 g，比表面积为 330 m²/g，柱内总表面积可达 1000 m²。当表面吸附浓度为 2 μmol/m² 时，需泵入 2 mmol 的离子对试剂才能实现完全平衡；若试剂浓度为 2 mmol/L，则需消耗 1 升流动相。这虽属极端情况，但实际操作中消耗几百毫升流动相也属正常。因此，将用于离子对色谱的色谱柱置于有机溶剂中过夜保存并不可取——此过程中离子对试剂会被洗脱，次日需再次进行耗时的平衡操作。
问： 上述两种情况存在一个共性：流动相中强吸附性试剂的浓度较低。这是否是导致保留时间漂移最常见的原因？
答： 是的，其他成因的出现概率远低于此。但强吸附性物质也可能来自样品本身，随重复进样逐渐在色谱柱上累积，进而改变色谱柱的化学性质，例如药物样品中辅料在柱上的吸附。
通过观察保留时间的变化速率，可判断污染源是来自流动相还是样品，具体可通过以下实验验证：
多次进样待测样品，例如进样 4 次，总运行时长 1 小时；
不进样，仅泵入流动相，持续相同的 1 小时；
重复步骤 1 的进样操作；
分别绘制保留时间-时间曲线与保留时间-进样次数曲线。
若第一张图呈现平滑趋势，说明污染物由流动相引入；若第二张图为平滑曲线，则样品是污染源。
问： 还有哪些因素会导致保留时间漂移？
答： 流动相组成随时间发生变化，也会引发这一问题。若未使用现代仪器的在线混合功能，流动相中的某一组分会缓慢挥发，尤其是采用氦气对流动相脱气以防止泵内产生气泡时，该现象更为明显，因此需将脱气速率控制在最低水平。
键合相的水解是另一个常被忽视的诱因。色谱柱制造商通常会标注键合相的适用 pH 范围，超出该范围则键合相处于“不稳定”状态，常规适用范围为 pH 2~8 或 pH 2~9。但对待该限值需格外谨慎：其并非明确的临界值，水解还受温度、有机溶剂等其他因素影响，即便在标注的 pH 范围内，键合相也可能发生缓慢水解。
键合相的水解稳定性在 pH 3~5 的中等酸度、低温条件下最佳，且等度条件优于梯度条件。等度条件下虽也会发生水解，但键合相通常会发生自吸附并处于局部平衡状态；而在梯度洗脱或色谱柱清洗过程中，由于使用了更高浓度的有机溶剂，这种局部平衡会被打破，水解后的键合相会被洗脱出色谱柱。
问： 我会留意这一点。那么温度变化是否会造成保留时间漂移？
答： 会的，温度是需要重点排查的因素。若在无人值守状态下过夜或周末运行样品，实验室环境温度的变化会直接导致保留时间漂移——许多实验室为节约能耗，会在夜间或周末调整环境温度。根据经验，温度每变化 1°C，保留时间约改变 1%~2%。
与温度相关的另一诱因是色谱柱背压升高引发的保留时间漂移：背压升高可能意味着色谱柱受到污染，即便只是筛板堵塞，也会影响保留时间。这是因为推动流动相通过堵塞筛板所需的压力会因摩擦使流动相温度升高，进而导致保留时间漂移。
此外，还有其他导致保留时间漂移的原因，但出现概率极低。
反相色谱中还存在一种特殊的慢平衡现象：当使用有机溶剂含量低于数个百分点的流动相时，高 C18 键合覆盖率的全封端填料难以被这类低有机相流动相润湿，进而引发一系列问题——从流动相与固定相接触不良，到“疏水塌陷”（即键合相发生自吸附，导致可与样品相互作用的有效表面积减少）。
针对该问题，可通入几倍柱体积的有机溶剂（优选流动相中的有机改性剂），实现色谱柱的快速再生。而对于非封端的键合相填料，上述现象则极不明显，甚至不会出现。
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